浙大:单细胞蛋白质组学技术可定量细胞中多达 3000 种蛋白质

编译：微科盟何小铵，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

导读

基于shotgun蛋白质组学分析是目前最有前途的单细胞蛋白质测序技术，但其每个细胞~1000种蛋白质的鉴定水平仍不足以用于实际应用。在这里，我们开发了一种拾取单细胞蛋白质组学分析（PiSPA）工作流程，以实现深度鉴定，能够使用无标记定量方法定量哺乳动物细胞中多达3000个蛋白质组。PiSPA工作流程是专门针对单细胞样品建立的，主要基于纳升级微流控液体处理机器人，能够在拾取操作策略下实现单细胞捕获、预处理和进样。使用这种定制的工作流程，在蛋白质鉴定方面有显著改进，在DIA（MBR）模式下，分别在单个A549细胞（n=37）、HeLa细胞（n=44）和U2OS细胞（n=27）中定量2449-3500、2278-3257和1621-2904个蛋白质组。得益于灵活的细胞拾取能力，我们在单细胞蛋白质组水平上研究了HeLa细胞迁移，展示了单细胞洞察在实际生物学研究中的潜力。

论文ID

原名：Pick-upsingle-cellproteomicanalysisforquantifyingupto3000proteinsinaMammaliancell

译名：PiSPA单细胞蛋白质组学技术可定量哺乳动物细胞中多达3000种蛋白质

期刊：NatureCommunications

IF：16.6

发表时间：2024.2

实验设计

结果

1.建立PiSPA工作流程

我们首先将先前由作者团队基于顺序操作液滴阵列(SODA)技术开发的改进的微流控液体处理机器人集成到PiSPA平台，在探针拾取模式下实现纳升级单细胞分选和多步预处理。PiSPA平台通过单细胞鉴定、拾取和分液三步操作进行细胞分选。在拾取模式下，根据细胞悬液样品中亮场表观特性或标记荧光信号，实现对靶细胞的自动亮场或荧光成像和鉴定，通过与高精度注射泵连接的锥形毛细管探针拾取单个靶细胞，并将靶细胞分配到内插管中。我们利用PiSPA平台分别提取了20个HeLa细胞，并将它们分别分配到不同的内插管中，以此来评估PiSPA平台的细胞分选性能。在优化条件下（即毛细管尖端直径为35μm，吸液流速为500nL/s，抽吸体积为25nL，进样体积为400nL），至少19个单个HeLa细胞成功分配到插入管中，单细胞分配率为95%（n=20）。为了确保细胞蛋白分析的准确性，我们使用了新鲜分离或培养的细胞样本。每个靶细胞的鉴定、拾取和分配的整个过程通常需要20s。因此，可以在10-20分钟内完成数十个单细胞的分选。我们观察到，将拾取的HeLa细胞分配到PBS液滴中后，这些细胞的形态完好无损，并且可以附着在容器的底表面。用于检测细胞活性的荧光染料也用于对细胞进行染色，表明它们可以保持其活力。检测细胞活性的荧光染料也被用来染色细胞，表明它们可以保持活力。细胞活力测定用荧光染料染色前和染色后的典型HeLa细胞在液滴中的图像如补充图1所示。

图1.单细胞蛋白质组学分析的PiSPA工作流程示意图。PiSPA工作流程使用基于探针的微流控处理机器人进行细胞分选和预处理，使用带有自动进样器的商用LC系统和tims-QTOF质谱仪。微流控液体处理机器人(a)采用内插管阵列(b)完成了单细胞的分选和单细胞样品的多步预处理，采用自动拾取操作模式，包括单靶细胞的分选(c)、纳升级细胞裂解(RG、RapiGestSF)、蛋白质还原(TCEP)、烷基化(IAA、碘乙酰胺)、酶切(Try、胰蛋白酶;Lys-C,胞内内切酶Lys-C)和酶切终止(FA，甲酸)(d)。内插管连接样品瓶作为纳升微反应器，对单细胞进行样品预处理(b)。样品预处理后，内插管和样品瓶作为LC系统自进样器的样品管，进行样品进样(e)、LC分离(f)和随后的质谱检测，对单细胞消化的肽组分进行检测(g,h)。

在探针捕获目标细胞后，我们控制平台将细胞分配到商业内插管中，而不是像之前报道的那样使用微芯片作为微反应器。这种新型的样品管可以与商用LC-MS系统的自动进样器无缝兼容，而不需要微加工微芯片和麻烦的进样操作。然而，即使是市场上最小的内插管，它们的体积仍有数百微升，这与单细胞样品预处理所需的纳升级微反应器相去甚远。我们使用内插管的锥形底端(内径2mm，高度0.4mm)来加载纳升反应溶液，从而解决了这一难题。此外，在内插管外的样品瓶中加入100μL的水和密封帽，形成内部高湿环境，抑制了纳米升反应溶液在加热反应过程中明显的蒸发效应。凭借对纳升级液体的精确操作能力，在拾取操作模式下，连续采用单细胞捕获平台完成多步纳升级试剂添加操作，依次实现细胞裂解、蛋白质还原、烷基化、消化和反应终止。我们对反应体积为微升(5μL)和纳升(~400nL)的单个HeLa细胞进行样品前处理的对比实验。纳升反应器的蛋白质鉴定数量是微升反应器的两倍(补充图2)。纳升反应器在单细胞蛋白质组学分析中的优势也已在许多文献中得到证实。

在蛋白质消化实验中，我们以单个HeLa细胞为样品，研究了酶/蛋白比对蛋白质鉴定数的影响。在常规的蛋白质组学实验中，酶蛋白比通常在1:100~1:10之间作为最佳消化条件。目前大多数单细胞蛋白质组学工作流程也遵循这个酶/蛋白质比率范围。然而，我们的实验结果(图2a)显示，随着酶/蛋白比的增加，单细胞蛋白鉴定数呈增加趋势。酶/蛋白比值在0~15:1范围内呈快速增长趋势，在15:1之后显著放缓。当酶蛋白比在40:1~60:1之间时，蛋白质鉴定数量达到最高水平(约1100个蛋白质组)，不同单细胞中鉴定的蛋白质数量波动(即CV)也达到最低水平。综合考虑蛋白质鉴定数和平台的工作稳定性，在后续的单细胞蛋白质组学分析实验中，我们最终选择了50:1的酶/蛋白比。这样的酶/蛋白比大大超过了大多数常规和单细胞蛋白质组学实验中使用的酶/蛋白比，有利于在纳升级反应溶液中保持相对较高的酶浓度(例如，在纳升级反应溶液中，酶的浓度为~12μg/mL)，以提高蛋白质的消化效率。使用大量酶的另一个可能的好处可能与单细胞分析的规模特性有关，即反应溶液中大量过量的酶分子可以作为吸附替代品，从而大大减少了样品预处理和注射过程中微量细胞蛋白和消化肽在微反应器表面和传输过程中的吸附损失。

为了检验较大的酶/蛋白比可能造成的负面影响，我们首先对空白对照样品(除单细胞样品外，包含所有预处理试剂)进行了蛋白质组学分析，没有鉴定出两种异源酶(胰蛋白酶和Lys-C)的蛋白质，对照样品的蛋白质鉴定号也处于很低的水平。说明酶及其自裂肽不会产生蛋白质的错认。我们还在典型的单个HeLa细胞的蛋白质组学分析色谱中检测了胰蛋白酶自裂肽的峰位和强度信号(补充图3)。可以观察到，这些酶的自裂肽的信号只出现在少数特定的保留时间和m/z位置上，对样品肽的鉴定没有明显的影响。

液相色谱分离中梯度程序的选择对色谱分离性能和蛋白质组鉴定结果有重要影响。我们评估了不同梯度时间对单细胞蛋白质组学分析的影响，使用梯度14、18、21、28、48和68min，并使用200pg标准HeLa细胞消化样品(图2b)。在18~28min梯度处理时，鉴定数达到最高，约600种，随着梯度时间的增加，鉴定数逐渐下降。与常规蛋白质组学分析的数十分钟梯度不同，研究结果表明，相对较短的梯度更有利于获得单细胞样品的高蛋白质鉴定数。这是因为短梯度有利于增加肽的信号峰强度，从而提高了对一些低丰度肽成分的识别，这些成分在蛋白质组学分析中具有重要的意义(如图4所示)。使用短梯度的另一个好处是可以提高蛋白质组学分析的通量。但是，过短的梯度(如14min梯度)会使分离效果变差，例如，在分离过程中，如果梯度过短(如14min梯度)，则会使分离效果变差，并导致蛋白质鉴定数减少。综合考虑分析通量和鉴定稳定性，我们最终在后续实验中选择了21min的LC梯度时间。

在对哺乳动物细胞进行单细胞蛋白质组学分析之前，我们首先在优化条件下对200pg商业HeLa细胞消化物作为质量控制(QC)样品在数据非依赖性采集(DIA)和数据依赖性采集(DDA)模式下进行连续10次分析，测试了LC-MS系统的重复性。DDA和DIA是蛋白质组学分析中广泛使用的两种质谱数据采集模式。DDA模式在MS1谱的基础上选择几个最强烈的前体离子，用于获取MS2谱和鉴定多肽。相比之下，DIA模式允许所有前体离子在一定的m/z和保留时间范围内破碎，从而获得样品中理论上所有肽的完整记录。平均而言，在DIA和DDA模式下分别获得1469和618个蛋白质组（图2c）并分别对应于变异系数为4.7%和2.3%进行了稳定量化。对10个QC样品的蛋白质定量数据进行两两相关分析(PythonpackagePandas,)，Pearson相关系数均大于0.99(DIA模式)和0.85(DDA模式)(图2d)，说明该系统在单细胞水平的蛋白质组学分析中具有良好的稳定性(特别是在DIA采集模式下)。

图2.系统优化和性能。a.单细胞蛋白质组学分析的酶/蛋白比优化。在DDA模式下，酶/蛋白水平分别为0、0.05、1、10、20、40、60和100时，平均定量251、312、450、899、911、1022、1057和1023个蛋白质组(n=3)。条件:样品，单个HeLa细胞；LC梯度时间，21min。梯度时间优化。在DDA模式下，平均定量529、602、618、610、516和412个蛋白组(n=3)，LC梯度分别为14、18、21、28、48和68min。条件:样品，200pg标准HeLa细胞消化物；酶/蛋白比50:1。(a,b)中，柱状图表示相应数据的平均值；误差棒表示标准差;单个数据点被覆盖。c,d使用LC-MS系统在DIA和DDA模式下连续10次分析200pg标准HeLa细胞消化样品的重复性测试，LC梯度时间为21min。DIA和DDA模式下的蛋白质鉴定数(c)及其两两分析的Pearson相关系数(d)给出结果。

2.在哺乳动物细胞的单细胞蛋白质组学分析

基于当前的工作流平台,我们进行了单细胞蛋白质组分析的三种类型的肿瘤细胞系A549,HeLa和U2OS细胞,使用DIA和DDA模式，最优酶/蛋白质比为50:1和梯度时间21分钟。在DIA模式下，分别在单个A549细胞（n=37）、HeLa细胞（n=44）和U2OS细胞（n=27）中定量了平均2467个（1804-3349）、2421个（1778-3049）和1705个（1074-2487）蛋白质组(图3a)。采用匹配间运行(MBR)算法，单个A549、HeLa和U2OS细胞中分别定量鉴定出平均3008(2449~3500)、2926(2278~3257)和2259(1621~2904)个蛋白质组。在DDA模式下，在相同的分析条件下，A549细胞(n=56)、HeLa细胞(n=68)和U2OS细胞(n=24)中平均定量1328(712-2129)、1290(664-2198)和1005(536-1519)个蛋白质组(图3a)。在DIA(MBR)模式下，A549、HeLa和U2OS单个细胞分别的2869、2772和1889个蛋白质组的重现率为80%(即复现率)，而只有638、722和1103个蛋白质组的重现率低于20%(图3b)。这些结果表明，PiSPA平台对单细胞的多数定量鉴定结果具有较高的重复性。在以上的单细胞蛋白质组学实验中，我们在DIA和DDA模式下分别捕获了143个和172个单细胞进行分析，最终获得了108个和148个有效单细胞数据，平均单细胞捕获/分析效率分别为76%和86%。

我们对A549、HeLa和U2OS的单细胞数据进行了UMAP降维，三种类型的单细胞样本都能自动清晰地聚类(图3d、e)，且所有的单细胞样本都能被正确聚类。

在DDA模式下，本工作获得的无标记单细胞蛋白鉴定数量(图3a)高于大多数文献报道的相同类型细胞(如HeLa细胞)的结果，这表明了目前的工作流程和平台在单细胞蛋白质组分析鉴定深度方面的优势。与DIA模式下获得的单细胞蛋白质组学数据集相比，基于DDA模式的单细胞蛋白质鉴定数量相对较低。在DIA模式下，37个单个A549细胞、44个单个HeLa细胞和27个单个U2OS细胞的数据集的结合，可以分别累计定量到总共5093、5048和4286个蛋白组(补充图5)。而在DDA模式下，56个单个A549细胞、68个单个HeLa细胞和24个单个U2OS细胞的数据集的结合，只能累计定量到3286、3319和2357个蛋白组。(补充图5)。在DIA和DDA模式下，蛋白质丰度范围分别跨越近5和4个数量级。一些重要但丰度低的蛋白质只能在DIA模式下定量（图3c），如错配修复核酸内切酶PMS2和E3泛素蛋白连接酶NEDD4。

图3.PiSPA平台在单个哺乳动物细胞蛋白质组学分析中的应用。aDIA和DDA模式下三种哺乳动物细胞（A549、HeLa和U2OS细胞）的定量蛋白质组数。在DIA模式下，使用匹配间运行（MBR）算法对单个A549、HeLa和U2OS细胞中平均3008（2449–3500，中位数=3013，n=37）、2926（2278–3257，中位数=2946，n=44）和2259（1621–2904，中位数=2200，n=27）蛋白质组进行定量，平均值为2467（1804–3349，中位数=2409，n=37）、2421（1778–3049，中位数=2409，n=44）和1705（1074-2487，中位数=1770，n=27）蛋白质组在相同的单个A549、HeLa和U2OS细胞中定量，无需MBR。在DDA模式下，在单个A549、HeLa和U2OS细胞中分别定量了1328个（712–2129，中位数=1282，n=56）、1290个（664–2198，中位数=1228，n=68）和1005个（536–1519，中位数=984，n=24）个蛋白组。条件：酶/蛋白质比例，50：1;LC梯度时间，21分钟。b.在（a）中，在DIA-MBR、DIA和DDA模式下，单个A549、HeLa和U2OS细胞中定量的蛋白质组的复现百分比分布。条形表示相应数据的平均值;误差线表示标准偏差;单个数据点被叠加。c，DIA（红点）和DDA（蓝点）模式下单个HeLa细胞中蛋白质丰度的排序顺序。一些仅在DIA模式下定量的蛋白质用彩色点标记。d,e.(a)中A549、HeLa和U2OS细胞在DIA(d)和DDA(e)模式下UMAP降维分析的比较。

3.LC-MS系统的定量准确度和精密度评估

为了评估本LC/MS系统的定量准确性和精密度，我们比较了0.2ng,0.4ng,0.6ng,0.8ng和1ngHeLa消化物的定量结果(n=6)。以2ngHeLa消化物为参考，计算每个定量蛋白质的蛋白质丰度差异倍数(FC)值，随着HeLa消化蛋白质量的增加，蛋白质折叠变化呈比例线性增加，R2为0.9995(图4a)。随着蛋白质量的增加，定量精度从200pgHeLa酶解时的变异系数(CV)为25.6%提高到1ngHeLa酶解时的14.9%(图4b)。结果表明，本LC-MS系统在单细胞和少量细胞水平上具有良好的定量准确度和精密度。

此外，我们还通过加入不同比例酵母和大肠杆菌肽的单细胞样品进一步测试了该系统的定量准确性。单细胞水平的QC样品是将8个消化的HeLa单细胞样品混合，然后引用成8份。通过混合8个消化的单个HeLa细胞样品，然后将其分成8份来制备单细胞水平的QC样品。将单细胞QC样品分为两组（S1和S2），每组4个样品，并加入酵母肽和大肠杆菌肽，每个样品的比例不同。将加标后的QC样品用LC-MS系统进行分析，结果表明，样品中三种蛋白的差异倍数中值与理论值非常吻合，存在相对差异，即(FC中值-理论值)/理论值，范围为-2%~+15%(图4c)。这进一步证明了目前系统的定量准确度很高。此外，在两个QC样品组中，三个物种的蛋白质定量结果CV值均低于20%(图4d)，也表明在单细胞水平上具有良好的定量精度。

得益于现有平台灵活准确地控制样品中细胞数量的能力，我们对含有0、1、2、3、5、10个HeLa细胞的样品采用与单细胞蛋白质组学分析相同的程序和条件进行测试，评估空白对照样品中的背景水平，并检验细胞数量对蛋白质鉴定数量的影响。在DIA(MBR)模式下，平均在0、1、2、3、5和10个HeLa细胞(n=4)中分别定量0、3000、3121、3411、3718和3864个蛋白质组(图4e)。蛋白质鉴定的数量并没有随着细胞数量的增加而线性增加(图4e)。然而，相对于单细胞样品的中位数差异倍数所反映的蛋白质丰度与细胞数呈线性关系(图4f)，FC值分别为1.64、2.69、3.26和6.02，R2为0.9848(图4f)。作为“蛋白质组学标尺”方法，我们使用关键词“组蛋白”检索了1-10个细胞HeLa数据中所有定量蛋白的描述，得到了40个组蛋白相关蛋白。以单细胞样品中这些蛋白的丰度为参照，在2、3、5和10个细胞(n=4)中，这些蛋白的定量倍数变化(中位数)分别为1.66、2.30、3.32和6.83，与细胞数量呈线性相关(补充图6)。这进一步证明了PiSPA系统在细胞捕获特异性和蛋白定量准确性方面的合格性能。

图4.LC-MS系统的定量准确度和精密度评估。a不同量的HeLa酶解物（0.2ng、0.4ng、0.6ng、0.8ng和1ng，n=6）的蛋白质丰度倍数变化(中位数=1.00,2.03,3.14,4.31和5.32)对应于不同量的HeLa消化(0.2ng,0.4ng,0.6ng,0.8ng和1ng,n=6)与0.2ngHeLa消化的平均蛋白质丰度。b.蛋白质在0.2ng、0.4ng、0.6ng、0.8ng和1.0ngHeLa消化液中的变异系数(CV)密度分布(中位数=25.6%、20.6%、17.3%、14.9%和14.7%，n=6)。c两组(S2/S1)加另外两种肽的消化单HeLa细胞QC样品中大肠杆菌(n=198)、人(n=2614)和酵母(n=463)蛋白丰度的变化(S1:单细胞QC加50pg酵母肽和150pg大肠杆菌肽);S2:单细胞QC，添加100pg酵母肽和100pg大肠杆菌肽;n=4)。黑线虚线表示理论折叠变化。d.(c)中三个物种在两个QC样品组中定量蛋白的CV密度分布。e.在DIA-MBR模式下对0、1、2、3、5和10个HeLa细胞(n=4)的蛋白数量进行定量。柱状图表示平均值;误差条表示标准差;单个数据点以红点表示。、2、3、5、10个HeLa细胞的蛋白丰度差异倍数(中位数=1.00、1.64、2.69、3.26、6.02,n=4)in(e)，以1个细胞样品的平均蛋白丰度为参考。在(a)(c)和(f)中，框内的中心线表示中位数;方框表示四分位数;须最大延伸到四分位数以外的1.5倍四分位数间距。

4.迁移细胞的单细胞蛋白质组学分析

细胞迁移是一种常见的生物学过程，对肿瘤迁移、伤口愈合、胚胎发育、免疫应答等方面的研究具有重要意义。目前，划痕实验多用于检测肿瘤贴壁细胞的侵袭转移能力，而在深覆盖蛋白组水平上对具有不同迁移行为的单个肿瘤细胞的研究尚无报道。PiSPA平台能够观察单个迁移细胞的行为，可靠地拾取目标细胞，并在单细胞水平上对这些细胞进行深度覆盖的蛋白质组学分析，以突出具有不同表观迁移特性的细胞之间的个体蛋白质差异。

我们使用HeLa细胞进行划痕实验，捕获46个具有明显迁移行为的单细胞(图5a，补充数据1)和43个没有明显迁移行为的单(对照)细胞，并使用PiSPA平台进行分析。在DIA(MBR)模式下，从单个迁移细胞(n=46)和对照细胞(n=43)中平均分别定量2544(2058-3308)和2893(96%-3710)个蛋白质组(补充数据2，补充数据3)。其中，超过78%的蛋白质被两个或两个以上的特征肽定量(补充图7)。

经过批量校正和归一化后，通过UMAP将数据聚类成三个不同的簇(图5b)。簇1(n=42)以迁移细胞为主(n=35,83%)，簇2(n=31)和簇3(n=16)以对照细胞为主(n=26,n=10，分别为83%和63%)。通过三个聚类的单独比较，筛选出226个差异显著的蛋白(Wilcoxon检验，,FC2)。利用层次聚类分析(HCA)定量评估三个聚类之间蛋白质组成的差异(图5c)，以表征不同聚类之间的异质性。

与簇2相比，簇1中有33种蛋白显著上调，13种蛋白显著下调(补充图8.Wilcoxontest,,FC2)，其中Orc1、TGFBI、MSLN、HtrA1等上调蛋白被报道与肿瘤细胞的迁移和侵袭有关。我们量化了这些蛋白在不同簇中的表达水平(补充图9)，观察到这些蛋白在簇2和簇3中都表现出明显的下调，这与两个簇中大多数细胞相对较弱的明显迁移行为相对应。我们进一步比较了簇1和簇3之间的蛋白表达差异。在簇1中，135种蛋白表达上调，36种蛋白表达下调(图5d,Wilcoxon检验，,foldchange2)。其中，Cdc42、Rac1、RhoA、EZR、THBS1、Itgb6、Rap1A、MYL12A、Myl9、MSN、Arpc1a等11种上调蛋白参与黏着斑和肌动蛋白细胞骨架调控信号通路（图5e，KEGG，），据报道，它们与细胞迁移密切相关。在以往报道的细胞迁移模型中，Cdc42的功能通常被认为是诱导丝状足形成并调节细胞迁移方向，Rac1的功能是诱导板足形成并在前缘建立新的粘附位点将细胞向前拉，RhoA的功能是促进后肌动蛋白收缩脱离粘连，最终导致细胞迁移。我们清楚地观察到，与簇3相比，簇1中上述蛋白质的表达显著上调，这意味着相关的相关迁移通路的激活，这与簇1细胞在迁移测定中表现出显着的表观迁移特性这一事实一致。有趣的是，我们比较了这三种蛋白在三个簇的单细胞水平上的表达水平(图5f)，结果显示，这三种蛋白在簇2细胞中的表达也高于簇3细胞，在对照细胞中表现出明显的异质性。这一结果表明，虽然簇2和簇3中的大多数细胞都没有表现出明显的迁移行为，但它们缺乏显著迁移行为的原因可能不同。簇2细胞中迁移相关蛋白的上调暗示了这些细胞潜在的强迁移活性，而它们并没有表现出实际的迁移行为，这可能是由于这些细胞周围缺乏迁移空间。这种存在于具有相似表型行为的细胞群内的细胞蛋白质异质性，除了使用单细胞蛋白质组学分析技术外，很难用常规的大细胞实验来观察和探索。

图5.PiSPA平台在划痕实验中单个迁移细胞蛋白质组学分析中的应用。在划痕实验中，捕获具有明显迁移行为的单个HeLa细胞46个和不具有明显迁移行为的单个HeLa细胞43个作为对照细胞进行划痕实验分析。条件:酶/蛋白比50:1;LC梯度时间，21min。a.显微镜图显示了在PiSPA平台捕获迁移的HeLa细胞(n=46)之前和之后在划痕实验中捕获目标细胞的操作。b.被测试的迁移HeLa细胞(方形)和对照HeLa细胞(圆形)的3DUMAP聚类分析，被聚为簇1(青色)，簇2(橙色)和簇3(蓝色)。c.(b)中三个簇中226种差异蛋白的分层聚类热图。d.火山图显示，与簇3相比，簇1细胞中筛选出135种上调蛋白和36种下调蛋白，其中包括11种参与黏着斑和肌动蛋白细胞骨架调节的信号通路。e.簇1和簇3细胞间差异蛋白的KEGG富集分析。“黏着斑”和“肌动蛋白细胞骨架调节”通路用红色标记。富集检验p值采用Benjamini-Hochberg校正进行调整。、Rac1和RhoA蛋白在簇1(n=42)、簇2(n=31)和簇3(n=16)细胞中的定量表达水平比较。框内中心线表示对应数据的中位数;方框表示四分位数;须最大延伸到四分位数以外的1.5倍四分位数间距;单个数据点被覆盖。调整后的p值如图所示。在(c,d,f)中，FC2和校正p值0.05来确定(双侧Wilcoxon检验，采用BenjaminiHochberg校正)。

使用“拾取（pick-up）”方法可以观察到细胞迁移过程中明显的细胞异质性，例如在同一簇中存在少量混合细胞。然而，受划痕实验在细胞迁移的条件控制和监测方面相对粗糙的操作模式的限制，目前的实验数据并不能对这些类型的细胞异质性提供明确的解释，这意味着细胞迁移行为与蛋白质表达之间可能存在更复杂的关系。为了进一步验证和深入研究这些关系，未来可以使用微流控芯片精确控制初始细胞的位置和状态，并使用活细胞工作站监测整个迁移过程，跟踪每个被测细胞的迁移路径。

目前单细胞蛋白质组学在细胞迁移实验中的应用只是一个初步的原理验证尝试，而它可以证明PiSPA平台有潜力揭示在大量细胞样本中使用常规组学方法难以检测到的明显行为背后的内在控制因素。为细胞迁移研究以及抗癌方法和药物的开发提供了有效的工具。

讨论

在本研究中，我们采用单细胞定制策略贯穿于单细胞蛋白质组学分析的平台构建、方法开发和性能改进的全过程，涵盖单细胞分选、样品预处理、色谱进样分离、质谱检测和数据处理等工作流程。开发了一种完整的解决方案，实现了蛋白质鉴定深度的飞跃提升和单细胞分析操作的可靠便捷。PiSPA平台使用拾取模式实现单细胞分选，这与流式细胞术、CellenONE或基于连续稀释的单细胞分选方法不同。在拾取模式下，根据细胞的亮场信息或荧光信息或其他性质，可以在显微镜视野中选择任意感兴趣的细胞作为靶细胞，在显微镜监测下由毛细管探针单独拾取靶细胞。因此，该方法在对靶细胞的选择和挑选上具有较强的可控性、确定性和可靠性，同时保留了这些靶细胞的表型和空间信息。这一特征已在细胞迁移实验中对迁移细胞的挑选中得到证明，这是使用基于流式细胞术的单细胞分选技术难以实现的。虽然PiSPA平台在单细胞分选中的通量(~20s/细胞)远低于基于流式细胞术的系统，但它仍然可以匹配目前大多数单细胞蛋白质组学分析系统每天数十个样品的通量。如果需要，细胞分选通量可以通过使用毛细管探针阵列进一步成倍增加。

PiSPA平台将微流控液体处理机器人与内插管阵列集成在一起，利用机器人的拾取操作和内插管的锥形底端作为纳升反应容器，实现单细胞液滴的加载和随后的多步纳升级样品预处理。与用特殊设备和复杂工艺制造的微芯片反应器相比，该内插管具有成本低、易于获得、使用方便等优点。此外，这样的安排也使得单细胞分选、纳升级样品预处理以及随后的样品自动化液相色谱进样的无缝集成，显著提高了单细胞蛋白质组学分析整个工作流程的可操作性、可靠性和成功率。这对于促进单细胞蛋白质组学分析的实际普及具有重要意义。

考虑到传统的包含数千个细胞的样品蛋白质组学分析通常可以识别约5000-7000个蛋白质组，PiSPA平台能够对单个哺乳动物细胞进行近一半的定量，比许多当前的单细胞蛋白质组学分析系统有显着改进。这可能意味着单细胞蛋白质组学研究已经进入了广泛应用于生物医学研究领域的实际应用阶段。

回顾十年前单细胞转录组测序技术鉴定深度的突破，基于Smart-seq的单细胞RNA-seq技术可以从一个人类哺乳动物细胞中鉴定约3万个转录本，占人类转录本总数的13%(约230,000个)。在本研究中，在一个人类哺乳动物细胞中，多达3000种蛋白质被量化，占人类蛋白质总数的15%(约20000)，达到了当时单细胞RNA-seq技术的类似水平。考虑到近十年来单细胞转录组测序技术的爆炸式发展，即使是在基于shotgun蛋白质组学策略的单细胞蛋白质测序技术的爆发中，我们也有很多人认为单细胞转录组测序技术的发展是前所未有的。

在不久的将来，单细胞蛋白质组学分析的鉴定深度和通量将进一步提高，达到实用和普及应用的水平。此外，通过采用微流控样品预处理技术，可以将其与单细胞基因组、转录组和代谢组分析技术相结合，形成针对单细胞个体的“真正”单细胞多组学分析技术。这些无疑将为人们带来前所未有的强大工具，让人们了解生命活动中细胞异质性的变化。