陈凡医生——氨甲蝶呤供者预处理对致敏大鼠移植心脏成活的影响

氨甲蝶呤供者预处理对致敏大鼠移植心脏成活的影响

陈凡李跃华宋惠民朱亚彬

【摘要】目的用大鼠皮肤致敏模型研究氨甲蝶呤供者预处理对移植心脏成活的影响及其与术后抗排斥治疗的协同效果。方法SD大鼠作供者‚Wistar大鼠作受者‚所有受者在心脏移植前均先用供者皮肤致敏‚依据受者治疗和供者预处理情况的不同‚将48只Wistar大鼠随机分成对照组、供者预处理组、受者治疗组和协同治疗组‚每组各12只。

（1）对照组作非供者预处理的供者心脏移植；（2）供者预处理组作经供者预处理后的供者心脏移植；（3）受者治疗组作非供者预处理的供者心脏移植后用环孢素A（CSA）100mg／kg·d治疗3天；（4）协同治疗组作经供者预处理后的供者心脏移植‚再用CSA治疗3天。观察4组手术前后红细胞免疫指标的动态变化‚供者心脏移植后存活时间‚淋巴细胞增殖反应‚供者心脏超微结构等变化。结果在细胞和体液免疫均较强的内环境中‚供者预处理组和协同治疗组的移植供者心脏成活时间均较对照组和受者治疗组明显延长。结论氨甲蝶呤供者预处理能明显延长移植供者心脏成活时间‚并与术后对受者的免疫抑制治疗有协同效果‚该法简单、实用‚对降低术后免疫抑制剂用量和毒副作用有一定的意义。

【关键词】氨甲蝶呤大鼠致敏模型供者预处理

ProlongedSurvivalofRatsCardiacAllograftsAfterDonorPretreatmentwithMethotrexate

ChenFan‚LiYuehua‚SongHuimin‚etal．

DepartmentofCardiacandThoracicSurgery‚TheFirstAffiliatedHospital‚NanjingRailwayMedicalCol-lege‚Nanjing210009‚P．R．China

【Abstract】ObjectiveUsingdonorskinsensitizedrecipientsandintra-abdominalheterotopiccardiactransplantproce-dure‚weinvestigatedtheeffectofdonorpretreatmentwithmethotrexateonthemeansurvivaltimeofcardiacallograftanditssynergisticeffectswithimmunosuppressanttherapy．MethodsSDratswereusedasskinandheartdonorandWistarratsusedasrecipient．Allrecipientsweresensitizedwithdonorskintransplantationbeforehearttransplantation．Accordingtothemethodsoftreatmenttothedonorsandrecipients‚48ratsweredividedinto4groups；（1）simplehearttransplantationascontrolgroup‚（2）pretreateddonorheartfortransplantation（donorpretreatedgroup）‚（3）unpretreateddonorheartfortransplantationfollowedwithcyclosporinA100mg／kg·dfor3daystotherecipient（recipienttreatedgroup）‚and（4）pretreateddonorheartwastransplantedandfollowedwithcyclosporinAtreatment（combinedtreatmentgroup）．Redbloodcellimmunityandlympho-cyteblastogenesisweredetermined‚meansurvivaltimeofcardiacallograftsanditsmicroscopicexaminationwereobserved．

ResultsIntheenvironmentofintensifiedhumoralandcellmediatedimmunity‚themeansurvivaltimeofcardiacallograftswasmuchprolongedindonorpretreatedgroupandcombinedtreatmentgroupincomparedwiththoseincontrolgroupandrecipienttreatedgrouprespectively．ConclusionDonorpretreatmentwithmethotrexatecouldincreasethesurvivaltimeofcardiacallo-grafts‚ifitiscombinedwiththoseofpostoperativeimmunosuppressivetherapyasynergisticeffectswillbeachieved．Thismethodcouldallowreductioninthedoseofimmunosuppressantdrugstotherecipientandthuslessenthetoxicityofimmunosuppressanttherapy．

【Keywords】MethotrexateImmunologicalsensitizedratsmodelDonorpretreatment

由于现代抗排斥药物的治疗‚心脏移植后5年成活率已达60％以上‚但尚不能完全抑制急性排斥反应‚而免疫抑制作用也严重影响患者的长期成活［1］。供者预处理有可能为减轻或延迟术后排斥反应提供一个独特而安全的途径‚为此我们用氨甲蝶呤作供者预处理‚观察它对供者心脏成活的影响及与术后抗排斥治疗的协同效果。

1材料与方法

1∙1实验动物和分组

纯种Wistar大鼠4月龄‚重300～400g‚雄性‚作皮肤和心脏移植受者；SD大鼠（均由山东医科大学实验动物中心提供）3～4月龄‚重250～300g‚雌雄不限‚作皮肤和心脏供者。根据供者预处理和受者治疗情况的不同‚将48只Wistar大鼠分为供者预处理组‚受者治疗组、协同治疗组和对照组‚每组12只。所有受者均在心脏移植前7～9天作皮肤移植以致敏大鼠。对照组作单纯心脏移植。供者预处理组作经供者预处理后的供者心脏移植‚观察预处理对移植供者心脏成活的影响；受者治疗组在单纯心脏移植后于术后当天腹腔内注射环孢素A（CSA）100mg／kg·d共3次‚以与供者预处理组对比；协同治疗组在作经供者预处理后的供者心脏移植后当天用CSA100mg／kg·d腹腔内注射‚共3次‚观察其协同效果。

1∙2方法

皮肤移植：所有受者均移植2cm供者全厚皮瓣于胸背部右侧以致敏大鼠‚胸背部左侧移植相应大小自体皮瓣作对照‚仔细剥除皮瓣下肌肉‚术毕酒精擦拭后外敷青霉素干粉0∙2g。

供者预处理：心脏摘取前12小时供者腹腔内注射250mg／kg氨甲蝶呤‚供者心脏摘取前1小时开腹经下腔静脉再注射1次。

腹腔内异位心脏移植：用2％戊巴比妥钠按40mg／kg腹腔内注射麻醉后作供者心脏摘取及移植‚供者心脏升主动脉与受者腹主动脉行端侧吻合‚供者心脏肺动脉与受者下腔静脉行端侧吻合‚血液循环方式为：受者腹主动脉→供者心脏主动脉→冠状循环→右心房→右心室→肺动脉→受者下腔静脉。移植物缺血时间在45分钟以内‚75％的移植物在吻合结束除去阻断重新获得血流时心肌立即开始收缩手术当天作为天记［2］

1∙3观察指标

1∙3∙1每天经腹壁触摸心跳情况‚必要时作心电图检查以记录供者心脏成活天数‚凡成活小于20小时者均作为手术意外不参与实验

1∙3∙2红细胞免疫功能测定皮肤移植前和移植后6天‚心脏移植后第1天和供者心脏停搏后当天取鼠尾血0∙5ml肝素抗凝‚用酵母菌花环法测红细胞C3b受体（RBC-C3bR）花环和红细胞粘附免疫复合物能力（RBC-IC花环活性）。

1∙3∙3淋巴细胞增殖实验移植供者心脏停搏后处死大鼠无菌取脾‚在200目铜网上研碎制备单个核细胞悬液‚RPMI-1640液调细胞浓度为5×109／L‚以刀豆素A（ConA）作丝裂原‚用氚标胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法测每分钟脉冲数（cpm值）‚并以此反映淋巴细胞增殖情况。

1∙3∙4移植心脏电子显微镜检查重点观察微血管病变。

1∙3∙5移植心脏排斥终点组织学变化。

1∙4统计学处理

全部数据用均数±标准差（-x±s）表示‚多样本均数比较用F检验‚两两比较用q检验‚两样本均数比较用t检验。等级资料比较用秩和检验。

1结果

2∙14组供者心脏成活情况

4组供者心脏存活情况见附表。经统计学处理各组间两两比较均差异显著（P＜0．01）。各组移植供者组间两两比较均差异显著（P＜0．01）。各组移植供者～190次／分。当发生排斥反应时‚心搏减弱‚心电图示电压低‚心率慢‚心律不齐‚QRS波宽大畸形‚最终停止跳动。

2．2淋巴细胞增殖实验

各组cpm值见附表。经统计学处理‚对照组与受者治疗组、协同治疗组以及供者预处理组与受者治疗组、协同治疗组间比较均差异有显著性（P＜0．01）。

2∙3移植供者心脏病理检查

按1990年国际心脏移植学会制定的急性心脏排斥反应诊断标准分级［3］‚结果见附表。经统计学处理对照组与受者治疗组以及供者预处理组与协同治疗组间比较无统计学差异‚但对照组与供者预处理组、与协同治疗组以及受者治疗组与供者预处理组、与协同治疗组间比较有差异（P＜0．05）。

2∙4红细胞免疫功能变化

皮肤移植后6天各组红细胞免疫功能均显著增高‚心脏移植后第1天下降明显‚但各组间无统计学差异（P＞0．05）‚到供者心脏停搏时对照组高于其它组‚有差异（P＜0．05）‚见图1～2。

2∙5移植心脏血管病变超微结构观察

对照组内皮细胞溶解‚基底膜断裂‚血细胞外渗‚破坏程度较重‚其余各组内皮细胞结构不清‚破坏程度稍轻‚4组的血管腔内外均有大量的电子致密物沉积（图3～4）。

3讨论

3∙1超敏反应模型

1994年国外报道［4］过该模型‚它所诱发的排斥反应类似临床所见因反复输血、妊娠等已出现的群体反应抗体（panelreactiveantibody‚PRA）阳性的患者‚属超急性排斥反应‚有细胞免疫参与‚同时也有体液免疫参与‚用此模型研究移植排斥可同时了解细胞

图4协同治疗组微血管超微结构改变1．5×6000

注：微血管内皮细胞结构不清‚基底膜溶解‚管腔内外大量电子致密物沉积

和体液免疫情况‚也缩短了研究周期。我们的实验中对照组在26小时左右发生排斥‚供者心脏病理检查有急性排斥表现‚红细胞免疫及淋巴细胞增殖实验反应强烈‚超微检查有急性血管排斥表现‚而我们同期实验非致敏大鼠在7天左右才发生排斥反应［5］‚表明这种模型是有效的‚心脏植入时‚宿主已处于高度细胞和体液免疫致敏状态。术后红细胞免疫降低可能与手术创伤有关。

3∙2免疫刺激细胞

免疫刺激细胞（immunostimulatorycells‚ISCs）是重要的抗原提呈细胞（APC）‚涉及到心脏的主要是间质、血液和淋巴树突状细胞‚属Ⅱ型主要组织相容性复合物（MHC-Ⅱ）阳性‚在同种异体移植时‚供者心脏MHC-Ⅱ可直接提呈抗原‚亦可被宿主APC间接提呈而启动排斥［7］。由于ISCs强烈的免疫原性‚Moller［6］提出如果在供者心脏植入前能将95％的ISCs消除‚移植供者心脏便有可能在不用任何抗排斥措施下长期成活。氨甲蝶呤用于治疗顽固性心脏和肺移植排斥获得良好疗效［8‚9］。我们的实验显示经氨甲蝶呤供者预处理后的供者心脏移植在红细胞免疫和淋巴细胞增殖实验均显示很强的免疫内环境下能明显延长移植心脏成活时间；在排斥终点时的病理排斥分级‚供者预处理组和协同治疗组明显低于对照组和受者治疗组。分析氨甲蝶呤对供者心脏免疫原性有一定程度的影响‚最大可能的作用对象便是ISCs‚协同治疗组成活时间最长说明供者预处理和抗排斥治疗有协同效果。我们认为该方法简便、实用‚对减少免疫抑制剂用量‚降低其毒副作用有一定意义‚尤其对慢性血管排斥反应‚因已有报道长期大量抗排斥治疗有可能加速移植心脏血管病变的发生［1］。

3∙3急性血管排斥反应

急性血管排斥反应（acutevascularrejection‚AVR）是由PRA导致的急性血管损伤并移植物损坏‚其成分主要是抗Ⅰ型主要组织相容性复合物（MHC-Ⅰ）抗体和抗MHC-Ⅱ抗体［10］‚非活化内皮细胞是MHC-Ⅰ阳性细胞‚当被干扰素（interferon-r）等细胞因子活化后又表达MHC-Ⅱ‚这便成了PRA的直接作用靶位。我们的实验各组均有程度不同的AVR‚血管内外大量电子致密物沉积‚这种物质很大可能便是抗原抗体复合物‚从病变程度看对照组较重‚供者预处理对AVR是否有预防作用尚难确定。

参考文献

1EmesonEE．AcceleratedatherosclerosisinhyperlipidemicC57bl／6micetreatedwithcyclosporinA．AmJPathol‚1993‚142（6）∶1906-1912∙

2陈凡‚宋惠民‚李跃华．改良大鼠异位心脏移植模型制作及ZT胶的应用．南京铁道医学院学报‚1999‚18（1）∶27-28．

3赵海路∙人类移植心脏的病理学进展∙中华医学杂志‚1995‚75（7）∶440-442∙

4陈凡‚宋惠民‚张彦恩‚等．供体脾细胞胸腺内注射对致敏大鼠移植心脏存活的影响∙中国免疫学杂志‚1999‚15（3）∶106-108∙

5李跃华‚陈凡∙两种大鼠异位心脏移植模型比较∙中华实验外科杂志‚1997‚14（2）∶114-117∙

6MollerE．Cellinteractionsandcytokinesintransplantationimmunity．TransplantProc‚1995‚27（1）∶24-28∙

7陈凡‚宋惠民∙心脏移植排斥的效应机制∙国外医学免疫学分册‚1996‚19（4）∶197-200∙

8Costanzo-NordinMK．Reversalofrecalcitrantcardiacallograftrejectionwithmethotrexate．Circulation‚1988‚78（Suppl3）∶47-54．

9BlumenstockDA．Pulmonaryfunctionofhaplotypematchedandmis-matchedallograftsindogstreatedwithtotalbodyirradiation‚autolo-gousmarrowtransplantation‚methotrexateanddonorblood．Trans-plantation‚1988‚46（4）∶496-503∙

10OlivariMT．Treatmentofacutevascularrejectionwithimmunoad-sorption．Circulation‚1994‚90（PtⅡ）∶70-77∙

（收稿：1998-09-22修回：1999-02-23）

（本文编辑冯桂娟）